一、背景
機械負荷是工程心血管組織中組織特性的強大調(diào)節(jié)劑。為了最終調(diào)節(jié)生化過程，必須量化機械負荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機硅層中，以允許心血管工程結(jié)構(gòu)的長期單軸循環(huán)機械應變。與未應變構(gòu)建體相比，這些構(gòu)建體承受了兩種不同的應變量級，并且在生化性能、力學性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面表現(xiàn)出差異。結(jié)果表明，當組織暴露于長時間的機械刺激時，會誘導具有較高交聯(lián)比例的膠原蛋白的產(chǎn)生。然而，以大應變大小的應變對組織的機械性能產(chǎn)生負面影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，動態(tài)應變誘導了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。所提出的模型系統(tǒng)可用于系統(tǒng)地優(yōu)化工程心血管組織的培養(yǎng)方案。
機械調(diào)節(jié)對細胞生物合成活性的影響已經(jīng)在二維和三維培養(yǎng)條件下進行了研究，并且這種效果取決于ECM的性質(zhì)。 通過使用各種培養(yǎng)系統(tǒng)（例如縱向拉伸裝置和真空驅(qū)動裝置）刺激細胞。 已經(jīng)進行了幾項研究，著眼于機械刺激對復雜幾何形狀的組織重塑的影響。在定義明確的簡單幾何中進行了類似的實驗。 塞利克塔等培養(yǎng)的。成纖維細胞填充的膠原凝膠（管狀構(gòu)建體）在存在下精確控制變形。只有有限數(shù)量的研究集中在明確定義的機械負荷對工程心血管組織特性的影響，其中研究了ECM的從頭形成（例如，用細胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）。需要對工程結(jié)構(gòu)中的組織特性進行機械控制。這需要詳細研究明確定義的加載條件對ECM合成和ECM組織的影響，以優(yōu)化加載方案。
二、材料和方法
細胞和組織培養(yǎng)
人隱靜脈細胞（HSVC，肌成纖維細胞）取自一名44歲的女性，并使用常規(guī)細胞培養(yǎng)方法生長。44細胞在由先進的Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基補充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素。
將支架真空干燥48小時，然后暴露于紫外線下1小時，隨后置于70%乙醇中4-5小時以獲得無菌。讓支架干燥過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水。在細胞接種之前，將組織培養(yǎng)基加入支架中16小時以促進細胞附著。使用纖維蛋白凝膠作為細胞載體，將第7代的HSVC細胞接種在這些支架上。細胞以每厘米約20萬個細胞的濃度接種隨后將組織構(gòu)建體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)（在37°C和5%CO2).組織培養(yǎng)基每3-4天更換一次，由補充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸。
應變拉伸
將工程心血管構(gòu)建體培養(yǎng)3周，包括6天無施加負荷以使細胞在接種后適應，然后以2 Hz的頻率進行1周的動態(tài)應變。應用三種不同的應變條件：0%應變，4%動態(tài)應變和8%動態(tài)應變（n = 8）。在以4%和8%應變的單獨樣品上進行所施加應變的測量2周和3周（n = 6）。
機械測試
培養(yǎng)3周后犧牲構(gòu)建體，并在1小時內(nèi)測試其機械性能（n = 6）。從樣品中除去有機硅層，并將剩余的組織置于組織培養(yǎng)基中以滋潤樣品。樣品的厚度和寬度使用以下命令測定 Plμ 2300 非接觸式光學圖像輪廓儀。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進行掃描。通過對代表性區(qū)域求平均值來獲得厚度和寬度。
組織形成的生化測定
三、結(jié)果
循環(huán)應變對組織性質(zhì)的影響
表征不同應變大小對工程心血管組織特性、構(gòu)建體的切線剛度以及 DNA、GAG、膠原蛋白和 HP 交聯(lián)量的影響（表1）被量化。相對于未應變的工程組織構(gòu)建體，循環(huán)菌株不會增加工程組織構(gòu)建體中每干重的DNA量。然而，與未過濾的組織結(jié)構(gòu)相比，機械應變結(jié)構(gòu)體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低。另一方面，在兩種應變條件下，每個三螺旋的HP交聯(lián)數(shù)量顯著增加。4%應變結(jié)構(gòu)的切線剛度等于未應變組織結(jié)構(gòu)的剛度，而8%應變結(jié)構(gòu)相對于未應變結(jié)構(gòu)和4%應變結(jié)構(gòu)的剛度均顯著降低（圖）。4).
細胞拉伸
圖4
3周齡工程心血管結(jié)構(gòu)的切線剛度（MPa）作為不同應變大小的函數(shù)。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05） 的顯著差異，表示與 4% 加載條件 （p < 0.05） 的顯著差異++
四、討論
機械負荷是活組織內(nèi)生化過程的重要調(diào)節(jié)器。為了調(diào)節(jié)這些生化過程，必須量化機械負荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。在這項研究中，提出了一個實驗框架，其中使用應變系統(tǒng)的改編版本在一次實驗中同時對單個樣品施加各種應變量級。系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量的樣品，并且易于長時間保持無菌狀態(tài)。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機硅層中，允許這些結(jié)構(gòu)的重復和單軸長期機械應變。這些構(gòu)建物附著在Bioflex孔（美國Flexcell Int. Corp.）上，經(jīng)受兩種不同的應變量級數(shù)周，與未應變的構(gòu)建物相比，在生化性能、機械性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面顯示出差異。結(jié)果表明，長時間的機械刺激誘導具有較高交聯(lián)分數(shù)的膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善了膠原蛋白的內(nèi)在機械性能。然而，過大的應變導致應變對組織的機械性能產(chǎn)生不利影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，應變誘導了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。
為了能夠拉伸三維工程心血管結(jié)構(gòu)，模型系統(tǒng)得到了進一步發(fā)展。組織結(jié)構(gòu)的組成部分之一是涂有P4HB的PGA，以前沒有表現(xiàn)出彈性材料行為。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態(tài)硅膠中。這允許對這些工程組織進行動態(tài)拉伸。在培養(yǎng)2周（1周菌株）后驗證應變場，支撐有機硅層的存在導致工程結(jié)構(gòu)的彈性響應，這可以通過在培養(yǎng)2周后保留最初施加的應變的事實來說明。然而，3周后的應變分布無法確定為結(jié)構(gòu)與支撐有機硅層部分分離，這大約對應于PGA機械完整性的損失。 雖然應變沒有確定，但動態(tài)成分仍然存在。這意味著受控應變最終可以在 2.5-3 周的時間內(nèi)應用。對不同應變場的分析表明，平均應變構(gòu)成了所施加的應變，對無組織構(gòu)建的膜進行了驗證。然而，組織結(jié)構(gòu)的應變分布更加不均勻?？赡埽痪鶆虻淖冃慰梢詺w因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性。設置的限制是組織形成（圖。5A-C）由于有機硅層存在下營養(yǎng)物質(zhì)供應減少而收縮到結(jié)構(gòu)表面。
在本研究中，動態(tài)應變對增殖沒有影響。動態(tài)菌株和未菌株構(gòu)建體之間每干重的DNA量沒有差異。以前，在相對長期的研究中，細胞增殖不受機械負荷的影響。2，28，38 然而，Mol等人。38確實顯示出自由浮動工程心血管結(jié)構(gòu)的增殖水平升高，這些結(jié)構(gòu)不受機械約束。必須認識到，在這項研究中，未應變的結(jié)構(gòu)并非沒有壓力。HSVC屬于肌成纖維細胞表型25，38，這些肌成纖維細胞產(chǎn)生連續(xù)的等長張力。24 由于工程結(jié)構(gòu)被支撐硅膠層限制為收縮，因此在結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生了內(nèi)部張力。（肌）成纖維細胞收縮產(chǎn)生的內(nèi)部應力足以限制細胞增殖。
體內(nèi)活細胞存在于動態(tài)的生理環(huán)境中，受到廣泛的機械刺激，包括拉伸、壓縮、剪切應力和流體靜壓力等。然而在一般的體外培養(yǎng)和分析條件下，細胞沒有受到來自生長環(huán)境的力學刺激。通過國產(chǎn)細胞拉伸儀，可以提供與體內(nèi)細胞相似的生理環(huán)境，幫助研究人員分析各種細胞培養(yǎng)應用中的拉伸負荷的生化變化，包括肌肉、肺、心臟、血管、皮膚等。
詳情介紹
國產(chǎn)細胞牽張拉伸應力加載系統(tǒng)
國產(chǎn)細胞牽張拉伸應力培養(yǎng)系統(tǒng)
技術(shù)背景：
當前細胞基礎研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實際“動態(tài)+立體"模式差別很大，導致細胞形態(tài)學、細胞分化、細胞間相互作用與體內(nèi)動態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細胞骨架重組、細胞形態(tài)以及基因蛋白表達改變等。
細胞牽張系統(tǒng)將帶來跨領域的創(chuàng)新：
●動物實驗前更可靠的評估
細胞拉伸儀腔體
●干細胞分化機制
●機械刺激力與癌癥的相關性
●生醫(yī)材料與細胞動態(tài)特性研究
●體外疾病微環(huán)境的快速建立
CELL TANK為細胞和組織模型提供機械拉伸條件的平臺。
國產(chǎn)細胞拉伸儀
CELL TANK為細胞牽張系統(tǒng)使科學家能夠輕松而精確地將仿生機械應變應用于細胞和組織。
拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm
拉伸腔體
可視化圖形操作界面
細胞拉伸儀界面
細胞拉伸儀界面
2. 細胞增殖后，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。
3. 根據(jù)實驗目標收獲/處理細胞，分析數(shù)據(jù)。
· 均勻負載
培養(yǎng)腔室采用預埋橫桿技術(shù)，保證每個細胞都沿著拉伸軸均勻地承受應變，非軸向方向上的次級載荷極低
· 高再現(xiàn)性
高精度步進電機保證在各種速度和拉伸比組合中實現(xiàn)一致的運動程序，機械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合，保證高度可重復的力學刺激
· 一體式控制
自帶觸摸控制屏，無需電腦。內(nèi)置ARM芯片，高效穩(wěn)定運行的同時簡單易用
· 多樣的拉伸模式
靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形
· 高通量培養(yǎng)腔室
有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實驗室分析技術(shù)，包括細胞固定和熒光成像等
外形尺寸 350x330x110 mm主機重量 3 kg拉伸腔體 4個，32x32 mm / 8個，20x20 mm控制模式 三角波、正弦波、方波及其組合最大應變率 30%最高拉伸速率 30 mm/s最高循環(huán)頻率 2 Hz基底膜厚度 0.2 mm使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱
拉伸腔有限元分析
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